Développement du bourgeon de membre

Résumé en cinq points

Notions et mécanismes

Le membre chiridien et ses trois axes

Le membre chiridien est le membre caractéristique des Tétrapodes. Il comporte trois segments successifs disposés de la base vers l'extrémité. Le stylopode comprend un os long unique. Le zeugopode comprend deux os longs parallèles. L'autopode comprend un ensemble de petits os proximaux, une rangée d'os allongés, puis les doigts formés de phalanges.

Ce membre présente trois axes de polarité, indépendants les uns des autres. L'axe proximo-distal va de l'insertion sur le tronc vers l'extrémité, c'est celui qui ordonne les trois segments. L'axe antéro-postérieur ordonne les doigts entre eux. L'axe dorso-ventral distingue les deux faces du membre, par exemple le dos de la main et la paume.

Expliquer le développement du membre, c'est expliquer comment ces trois axes sont spécifiés.

Le bourgeon de membre

Au cours de l'organogenèse, le membre se forme à partir d'un bourgeon, petite excroissance apparaissant sur le flanc de l'embryon. Ce bourgeon est constitué d'un massif interne de cellules mésenchymateuses d'origine mésodermique, recouvert d'un épithélium ectodermique. Des cellules d'origine somitique y migrent également, et donneront les muscles.

Le bourgeon s'allonge selon l'axe proximo-distal. Les pièces squelettiques se différencient progressivement, d'abord le stylopode, puis le zeugopode, enfin l'autopode. Il y a donc une correspondance entre l'ordre temporel de la différenciation et l'ordre spatial des segments.

L'autopode est d'abord une palette arrondie et pleine. Les ébauches des doigts s'y différencient sous forme de rayons. Les cellules situées entre ces rayons meurent alors par mort cellulaire programmée, ce qui creuse les espaces interdigitaux et sépare les doigts. Le nombre de doigts obtenu varie selon les espèces, et l'étendue de cette mort cellulaire en est l'un des déterminants. Une mort interdigitale réduite ou absente laisse une palmure entre les doigts. Les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire programmée ne sont pas au programme.

Le concept d'induction

Une induction est l'action d'un groupe de cellules, dit inducteur, qui modifie le devenir d'un autre groupe de cellules, dit induit ou répondeur. Le signal est le plus souvent une molécule sécrétée agissant sur les cellules voisines, donc un facteur paracrine.

Deux conditions sont nécessaires pour qu'une induction réussisse. Le territoire inducteur doit produire le signal, et le territoire cible doit être capable d'y répondre. Cette capacité de réponse s'appelle la compétence. Elle n'est ni permanente ni universelle. Un même territoire est compétent pendant une fenêtre de temps limitée, et des territoires différents répondent différemment au même signal.

Ces deux paramètres, l'âge et la localisation, sont au centre des exercices sur l'induction. Une greffe qui réussit avec un donneur jeune et échoue avec un donneur âgé montre que l'inducteur perd son activité. Une greffe qui réussit sur un receveur jeune et échoue sur un receveur âgé montre que le répondeur perd sa compétence. Il faut donc toujours préciser lequel des deux partenaires est en cause.

Le développement procède par cascades d'induction. Un territoire induit acquiert de nouvelles propriétés, dont celle de produire à son tour un signal qui agira sur un troisième territoire. De proche en proche, les territoires sont ainsi spécifiés de plus en plus finement. La spécification est progressive et non immédiate, ce qui explique qu'un territoire précoce puisse encore changer de devenir alors qu'un territoire plus tardif en est incapable.

Un morphogène

Un morphogène est une substance qui diffuse à partir d'une source localisée et qui forme un gradient de concentration dans le tissu. Les cellules répondent différemment selon la concentration qu'elles perçoivent, par exemple en franchissant des seuils successifs. Une source ponctuelle unique suffit alors à spécifier plusieurs devenirs cellulaires distincts en fonction de la distance à cette source.

La démonstration expérimentale du caractère morphogène d'un facteur repose sur deux arguments complémentaires. Il faut montrer que le facteur suffit à reproduire l'effet, en le déposant par exemple sur une bille imprégnée à la place du centre inducteur retiré. Et il faut montrer que la réponse dépend de la dose, des concentrations croissantes produisant des structures différentes et ordonnées.

Les centres inducteurs du bourgeon

Le programme demande un modèle simple, limité à quelques facteurs paracrines appartenant à la famille des FGF, à Shh et à Wnt, sans détail des voies de signalisation.

Le premier centre est un épaississement de l'ectoderme situé à l'extrémité distale du bourgeon, formant une crête. Il produit des facteurs de la famille des FGF et contrôle l'axe proximo-distal. Son rôle est de maintenir, dans le mésenchyme situé juste en dessous, un état de prolifération active qui permet l'allongement du bourgeon. Les arguments expérimentaux sont clairs. Son ablation arrête l'allongement et donne un membre tronqué, et le niveau de la troncature dépend du moment de l'ablation, une ablation précoce supprimant davantage de segments qu'une ablation tardive. Le dépôt d'une bille imprégnée de FGF à la place de la crête retirée restaure un allongement normal, ce qui identifie le signal.

Le deuxième centre est un petit territoire de mésenchyme situé au bord postérieur du bourgeon. Il produit Shh et contrôle l'axe antéro-postérieur, donc l'identité des doigts. L'argument décisif est une greffe. Si l'on transplante ce territoire au bord antérieur d'un bourgeon receveur, il se forme un membre à doigts surnuméraires disposés en miroir, avec une symétrie par rapport à un plan médian. Le même résultat s'obtient avec une bille imprégnée de Shh, et le nombre ainsi que l'identité des doigts supplémentaires varient avec la quantité déposée, ce qui établit le caractère morphogène du facteur.

Le troisième centre est l'ectoderme de la face dorsale du bourgeon, qui produit un facteur de la famille Wnt et contrôle l'axe dorso-ventral. Une inversion expérimentale de l'ectoderme par rapport au mésenchyme inverse les caractères dorsaux et ventraux du membre formé.

Ces centres ne fonctionnent pas indépendamment. Ils interagissent par des boucles de régulation. Le maintien de la production de Shh par le mésenchyme postérieur dépend des FGF de la crête, et réciproquement le maintien de la crête dépend de signaux venus du mésenchyme. Cette interdépendance explique qu'une atteinte de l'un des centres perturbe aussi les autres axes.

Les gènes Hox

Les gènes homéotiques du groupe Hox codent des facteurs de transcription, c'est-à-dire des protéines qui se fixent sur l'ADN et contrôlent l'expression d'autres gènes. Ils attribuent une identité positionnelle. Leur intervention ne consiste pas à construire une structure, mais à préciser quelle structure sera construite à un endroit donné.

Ils sont organisés en complexes chromosomiques, c'est-à-dire en groupes de gènes voisins alignés sur le chromosome, les Vertébrés en possédant plusieurs issus de duplications.

La propriété remarquable de ces complexes est la colinéarité. L'ordre des gènes sur le chromosome correspond à l'ordre de leurs domaines d'expression le long de l'axe du corps ou du membre. Il correspond également à l'ordre chronologique de leur activation, les gènes situés à une extrémité du complexe étant exprimés les premiers et dans les régions les plus antérieures ou les plus proximales. Une organisation génomique est donc directement lisible dans un patron d'expression, et c'est exactement ce que l'on demande de corréler à partir de documents.

Deux rôles sont au programme. Premièrement, la position des membres le long de l'axe antéro-postérieur du tronc, ainsi que l'identité du membre formé, dépendent de la combinaison de gènes Hox exprimés au niveau considéré. C'est la raison pour laquelle un bourgeon situé en avant donne un membre antérieur et un bourgeon situé en arrière un membre postérieur, alors que les deux se développent avec les mêmes centres inducteurs. Deuxièmement, l'identité des segments le long de l'axe proximo-distal du membre dépend elle aussi d'une combinaison d'expression, des vagues successives d'activation correspondant au stylopode, au zeugopode puis à l'autopode. L'étude se limite à ces deux aspects.

Les arguments expérimentaux proviennent de l'analyse d'organismes génétiquement modifiés. L'inactivation d'un gène Hox ou d'un groupe de gènes Hox entraîne l'absence, la réduction ou la transformation d'un segment, sans supprimer le membre entier, ce qui montre bien qu'il s'agit d'une attribution d'identité et non d'une construction.

Exemples et organismes de référence

L'embryon de Poulet est le matériel classique de ces expériences, car l'oeuf peut être ouvert et refermé, ce qui rend les greffes et les ablations réalisables. Les greffes entre embryons de deux espèces d'Oiseaux permettent de reconnaître ensuite l'origine des cellules.

Les variations du membre chiridien fournissent les exemples comparatifs demandés. Au sein d'un même organisme, le membre de la ceinture antérieure et celui de la ceinture postérieure partagent le même plan à trois segments, mais diffèrent par les proportions et par la forme des pièces. Entre organismes, le nombre de doigts varie, depuis un seul doigt fonctionnel chez certains Mammifères coureurs jusqu'à cinq chez beaucoup d'autres. Les proportions varient également, un membre antérieur de Chiroptère présentant des doigts très allongés reliés par une membrane, alors qu'un membre antérieur de Cétacé est raccourci et aplati. Toutes ces formes sont des homologues, c'est-à-dire des variations d'un même plan d'organisation hérité d'un ancêtre commun.

Les ordres de grandeur utiles sont ceux d'un bourgeon de membre, de l'ordre du millimètre au moment où les centres inducteurs agissent, et d'une bille imprégnée, de l'ordre de la centaine de micromètres, ce qui permet un dépôt local sans détruire le tissu.

Méthodes et savoir-faire

Connaître le principe des techniques imposées par le programme. L'hybridation in situ utilise une sonde d'acide nucléique marquée, complémentaire d'un ARN messager donné, et révèle donc où ce gène est transcrit dans l'embryon. L'immunocytochimie utilise un anticorps marqué dirigé contre une protéine et révèle où cette protéine est présente. Un gène rapporteur consiste à associer la séquence régulatrice du gène étudié à une séquence codant une protéine facilement détectable, ce qui rend visible le lieu et le moment d'activation du promoteur. L'ablation supprime un groupe de cellules pour tester sa nécessité. La greffe le déplace pour tester sa suffisance et son autonomie. L'application d'un facteur diffusible, par bille imprégnée, teste la suffisance de la molécule seule. Les organismes génétiquement modifiés permettent d'inactiver ou de surexprimer un gène précis. La radiographie aux rayons X visualise les pièces squelettiques du membre formé et sert donc à lire le résultat final.

Construire une analyse expérimentale rigoureuse. La structure de la réponse est toujours la même. Décrire précisément le protocole, y compris le témoin. Décrire le résultat sans l'interpréter. Comparer au témoin. Conclure sur ce que l'expérience établit, et seulement sur cela. Une ablation qui supprime un effet montre une nécessité. Une greffe ou une application qui reproduit l'effet montre une suffisance. Les deux ensemble sont nécessaires pour conclure fermement.

Savoir raisonner sur la chronologie. Faire varier l'âge du donneur teste l'inducteur, faire varier l'âge du receveur teste la compétence, faire varier le moment de l'ablation renseigne sur ce qui était déjà spécifié.

Corréler une organisation génomique et un patron d'expression. On dispose d'une carte du complexe et d'une série d'images d'hybridation in situ. Il faut montrer que l'ordre des gènes sur le chromosome se retrouve dans l'ordre des domaines d'expression, puis nommer cette propriété.

Comparer des membres chiridiens en distinguant ce qui est commun, le plan à trois segments, et ce qui varie, le nombre et les proportions des pièces, puis relier ces variations au mode de vie.

Ce qu'il faut savoir mobiliser en colle et à l'écrit

1. Le schéma du membre chiridien avec les trois segments nommés, les os correspondants et les trois axes de polarité fléchés.
2. Le schéma du bourgeon de membre en coupe, avec mésenchyme, ectoderme, crête apicale et territoire postérieur producteur de Shh.
3. Le protocole et le résultat de l'ablation de la crête apicale à deux âges différents, avec les deux membres tronqués obtenus.
4. Le protocole et le résultat de la greffe du territoire postérieur en position antérieure, avec le schéma du membre en miroir.
5. La définition de morphogène et les deux arguments expérimentaux qui l'établissent, suffisance et dépendance à la dose.
6. Le schéma de la colinéarité, complexe Hox d'un côté, domaines d'expression de l'autre, avec les correspondances tracées.
7. Piège fréquent, conclure d'une ablation que le territoire retiré est suffisant. Une ablation ne démontre qu'une nécessité.
8. Piège fréquent, dire qu'un gène Hox fabrique un segment. Il attribue une identité, la construction résultant des programmes cellulaires qu'il déclenche.

Notions et mécanismes clés

• Nécessité : une structure est nécessaire à un effet si sa suppression abolit cet effet. Elle se teste par ablation ou par inactivation génétique.
• Suffisance : une structure ou une molécule est suffisante si elle produit l'effet dans un contexte où il n'aurait pas lieu. Elle se teste par greffe ectopique ou par bille imprégnée.
• Autonomie d'un greffon : le greffon se développe selon son origine et non selon sa nouvelle position. On dit alors qu'il est déterminé.
• Spécification et détermination : un territoire spécifié suit son devenir en culture isolée mais peut encore en changer. Un territoire déterminé le conserve même après transplantation.
• Signal permissif : il autorise un développement sans en fixer la nature. La crête apicale est surtout permissive, puisqu'elle entretient la prolifération.
• Signal instructif : il impose un devenir particulier selon sa nature ou sa dose. Shh est instructif pour l'identité des doigts.
• Fenêtre de compétence : intervalle de temps pendant lequel un tissu répond à un signal donné.
• Zone de progression : mésenchyme distal prolifératif situé sous la crête. Dans le modèle classique, son devenir proximo-distal dépend du temps passé sous l'influence de la crête.
• Zone d'activité polarisante : nom historique du territoire mésenchymateux postérieur producteur de Shh.
• Duplication en miroir : membre dont les doigts se répètent de part et d'autre d'un plan de symétrie. C'est le signe d'une seconde source de signal antéro-postérieur.
• Paralogues Hox : gènes de même rang appartenant à des complexes différents, par exemple Hoxa11 et Hoxd11. Ils ont des fonctions en partie redondantes.
• Colinéarité spatiale et temporelle : l'ordre des gènes dans le complexe correspond à l'ordre de leurs domaines d'expression et à l'ordre de leur activation.
• Homologie : même plan d'organisation hérité d'un ancêtre commun, quelles que soient la forme et la fonction.

Chaînes de raisonnement

Pourquoi l'ablation de la crête tronque le membre à un niveau qui dépend de l'âge. Les segments se forment dans l'ordre proximo-distal, le stylopode d'abord, l'autopode en dernier. Une ablation arrête la prolifération du mésenchyme distal, donc seuls les segments déjà spécifiés se forment. Plus l'ablation est tardive, plus le nombre de segments déjà acquis est grand, et plus la troncature est distale.

Pourquoi la crête est permissive et le mésenchyme instructif. Si l'on associe une crête âgée à un mésenchyme jeune, on obtient un membre complet. Si l'on associe une crête de patte à un mésenchyme d'aile, on obtient une aile. L'identité du membre et de ses segments est donc portée par le mésenchyme, et la crête ne fait que permettre sa croissance.

Du gradient de Shh à l'identité des doigts. Shh est produit au bord postérieur et diffuse vers l'avant, ce qui crée un gradient décroissant. Les cellules exposées à une forte concentration, ou exposées longtemps, deviennent des doigts postérieurs. Celles qui reçoivent peu de signal deviennent des doigts antérieurs. Une seconde source antérieure crée un second gradient symétrique, d'où la disposition en miroir.

Des boucles entre centres aux phénotypes combinés. La crête entretient la production de Shh, et Shh entretient en retour la crête par un relais mésenchymateux. Le Wnt de l'ectoderme dorsal contribue aussi au maintien de Shh. Une atteinte d'un seul centre peut donc perturber deux ou trois axes à la fois, et il faut savoir le repérer sur un phénotype.

Du code Hox du flanc à la position et au type de membre. Le mésoderme latéral exprime une combinaison de gènes Hox différente à chaque niveau de l'axe antéro-postérieur. Le bourgeon apparaît aux niveaux où la combinaison le permet, et son mésenchyme hérite de l'identité antérieure ou postérieure. Les mêmes centres inducteurs construisent alors une aile ou une patte selon ce code.

Du code Hox proximo-distal à l'identité des segments. Dans le membre, les gènes des paralogues 9 à 13 s'activent en vagues successives. Schématiquement, les groupes 9 et 10 dominent dans le stylopode, le groupe 11 dans le zeugopode, les groupes 12 et 13 dans l'autopode. Inactiver un groupe entier réduit ou supprime le segment correspondant sans toucher aux autres, ce qui prouve une attribution d'identité.

Exemples et références à connaître

1. John Saunders, fin des années 1940 : ablation de la crête apicale chez le Poulet, qui donne un membre tronqué. Avec Mary Gasseling, fin des années 1960 : greffe du mésenchyme postérieur au bord antérieur, qui donne une duplication en miroir. Ce sont les deux expériences fondatrices du chapitre.
2. Aile de Poulet : trois doigts, notés classiquement 2, 3 et 4 de l'avant vers l'arrière. La greffe postérieure en position antérieure donne la séquence 4 3 2 2 3 4. C'est le schéma attendu en colle.
3. Cheryll Tickle : peu de cellules polarisantes greffées donnent seulement un doigt 2 surnuméraire. Davantage de cellules donnent un doigt 3, puis un doigt 4. C'est l'argument dose-réponse, obtenu avant l'identification de la molécule.
4. Identification de Shh en 1993 : le gène est exprimé exactement dans le territoire polarisant, et des cellules qui le produisent reproduisent la duplication. Il faut savoir faire le lien entre hybridation in situ et greffe.
5. Billes de FGF : placées à la place de la crête retirée, elles permettent la formation d'un membre presque complet. Placées dans le flanc entre les deux bourgeons, elles induisent un membre surnuméraire, plutôt une aile vers l'avant et plutôt une patte vers l'arrière.
6. Acide rétinoïque : une bille antérieure donne une duplication en miroir. On a d'abord cru à un morphogène, mais il induit en réalité l'expression de Shh au bord antérieur. C'est l'exemple type du piège sur l'interprétation d'une suffisance.
7. Souris invalidées pour Wnt7a : la face dorsale de l'autopode prend des caractères ventraux, par exemple des coussinets sur les deux faces, et les doigts postérieurs sont souvent affectés. C'est l'illustration du troisième centre et de ses interactions.
8. Souris invalidées pour tous les paralogues d'un même groupe Hox : sans le groupe 11, le zeugopode est très réduit. Sans les gènes Hoxa13 et Hoxd13, l'autopode ne se forme pas. Les autres segments restent présents.
9. Frontière antérieure d'expression de Hoxc6 : chez des Vertébrés dont le cou a des longueurs différentes, elle coïncide toujours avec le niveau d'insertion du membre antérieur. Le nombre de vertèbres cervicales varie, mais la correspondance entre code Hox et membre ne varie pas.
10. Patte de Canard : la mort cellulaire interdigitale y est réduite, ce qui laisse une palmure. L'aile de Chiroptère conserve aussi des tissus interdigitaux. Ce sont deux exemples du lien entre mort programmée et forme du membre.

Techniques

Analyser une expérience d'ablation ou de greffe

On suit un réflexe en cinq temps. Identifier ce qui est enlevé, déplacé ou ajouté, et à quel stade. Identifier le témoin, qui est souvent le membre controlatéral ou une bille imprégnée de solvant seul. Décrire le squelette obtenu, segment par segment et doigt par doigt. Comparer au témoin. Conclure en termes de nécessité, de suffisance ou d'autonomie, et ne rien conclure d'autre.

Mini-exemple. On greffe le mésenchyme postérieur d'un bourgeon de patte au bord antérieur d'un bourgeon d'aile. On obtient une aile avec des doigts d'aile surnuméraires en miroir. Conclusion : le signal postérieur est commun aux deux membres, et c'est le mésenchyme receveur qui décide que les doigts seront des doigts d'aile.

Lire une série d'hybridations in situ Hox

Placer la carte du complexe à gauche, du côté 3' vers le côté 5', et les images d'embryons à droite. Pour chaque gène, noter la limite antérieure ou proximale du domaine et le stade d'apparition. Tracer les correspondances. Conclure par la phrase attendue : les gènes situés vers l'extrémité 5' sont exprimés plus tard et plus postérieurement ou plus distalement, c'est la colinéarité spatiale et temporelle.

Le schéma bilan des trois centres

Dessiner un bourgeon en perspective avec ses trois axes fléchés. Placer la crête apicale et une flèche FGF vers le mésenchyme distal, avec la mention « prolifération, axe proximo-distal ». Placer le territoire postérieur et un gradient de Shh vers l'avant, avec la mention « identité des doigts ». Placer l'ectoderme dorsal avec Wnt. Ajouter deux flèches de rétroaction, de la crête vers le territoire postérieur et du territoire postérieur vers la crête. Écrire en marge le code Hox du mésenchyme.

Construire une synthèse sur ce chapitre

Le gabarit tient en trois parties : un objet à trois axes, trois centres qui les spécifient, un code Hox qui donne l'identité. On termine sur l'unité et la diversité du membre chiridien. Chaque partie s'appuie sur une expérience décrite, sinon la copie devient récitative.

Sujets classiques traités

Choisis ton niveau. Difficulté indicative ; les exercices qui se suivent restent dans l'ordre.

Erreurs fréquentes